Jun 16, 2023
ラピッドとラベル
Scientific Reports volume 12、記事番号: 21413 (2022) この記事を引用する 941 アクセス 4 引用 メトリクスの詳細 この研究では、迅速かつラベルフリーの開発を実証します。
Scientific Reports volume 12、記事番号: 21413 (2022) この記事を引用
941 アクセス
4 引用
メトリクスの詳細
この研究では、新しい刺激応答チオマー ナノブラシ材料を使用して、リステリア モノサイトゲネスを検出するための高速かつラベルフリーの電気化学バイオセンサーの開発を実証します。 ナノブラシは、ナノプラチナ (Pt) とアルギン酸チオメル (ALG チオメル) のワンステップ同時共蒸着によって開発されました。 ALG-チオマー/Pt ナノブラシ プラットフォームは、電極の平均電気活性表面積を 7 倍に大幅に増加させ、アルギン酸塩の作動特性 (pH 刺激による浸透圧膨張) を維持しました。 ブラシ作動中の誘電挙動は、アルギン酸塩の等電点の上下で正、中性、および負に帯電したレドックスプローブを使用して特性評価され、ALG-チオメル表面電荷が信号取得において重要な役割を果たしていることが示されました。 ALG チオマー プラットフォームは、バイオセンシング アプリケーションのために、リステリアのインターナリン A タンパク質に対して選択的なアプタマーで生体機能化されました。 アプタマーのローディングが最適化され、さまざまな細胞捕捉戦略が調査されました (ブラシを拡張した場合と折りたたんだ場合)。 ALG-チオマー/アプタマーが拡張立体構造 (pH > 3.5) にある場合に最大の細胞捕捉が起こり、続いて崩壊立体構造 (pH < 3.5) でのインピーダンス測定が行われます。 低濃度の細菌 (5 CFU mL-1) が複雑な食品マトリックス (チキンブロス) から検出され、他のグラム陽性細菌 (黄色ブドウ球菌) に対する選択性試験により、これらの pH 値でもアプタマー親和性が維持されることが示されました。 新しいハイブリッドソフトマテリアルは、これまでのリステリア菌バイオセンシングにおいて最も効率的かつ最速（17分）であり、サンプルの前処理を必要とせず、小分子または細胞をセンシングするための有望な新材料プラットフォームを構成します。
リステリア モノサイトゲネスは、環境 (土壌と水) に遍在する有毒な食中毒菌であり、米国では毎年数百人の死者を出しています 1,2。 毎年、約 4,800 万件の食中毒が報告されており、その約 19% はリステリア モノサイトゲネスの感染によるもので、医療費、生産性の低下、人命の損失により、潜在的に 150 億ドルの経済的悪影響を及ぼします 3,4。 筋肉痛、吐き気、下痢、嘔吐、悪寒などの症状を伴うリステリア モノサイトゲネスは、食中毒の中で最も致死性の高い病原菌の 1 つであり、高リスクの人の致死率は最大 30% です 5,6。 これは妊婦にとって特に危険であり、通常は回復しても、赤ちゃんは生き残れない可能性があります2。
リステリア モノサイトゲネスは、低水分含量、高塩分条件、または一般的な冷蔵庫/冷凍庫ユニットに関連する温度で増殖する能力があるため、食品加工環境での監視が困難な病原体です7。 インスタント食品中のリステリア・モノサイトゲネスに対するゼロトレランス規則は、米国食品医薬品局 (FDA)、米国農務省 (USDA)、および欧州連合 (EU) 1 によって実施されました。近年、リステリア汚染に関連した食品リコールの件数が増加しており8、汚染された食品を公衆の手に渡る前に特定できるリアルタイムの病原体検出方法の必要性がさらに高まっています。
総生菌数 (TVC)、ELISA (酵素免疫吸着法)、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) など、食品加工工場でリステリア菌を検出するための現在の最先端技術は、エラーや誤った測定値が発生しやすいものです。また、これを完了するには、高度な訓練を受けた人員を配置した高価な実験室環境が必要です9,10。 これらの方法は感度 [約 100 CFU mL-1 の検出限界 (LOD)] に欠けているため、定性的検出ステップ 11 の前に細菌を濃縮/増幅するための 2 つの連続した濃縮ステップ (最長 48 時間) が必要となるため、これらの方法による検査結果は大幅に遅れます。 ]12,13 であり、培地、培養液、均質化組織などの複雑なサンプル中の低レベルの病原体を直接検出することはできません。
0.97), the sensitivity to the target bacterium was obtained using the slope of the linear portion and then the 3σ method was used to calculate the limit of detection (LOD)39. Change in impedance (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{bacteria}-{Z}_{no \, bacteria}\)) was used to illustrate the electrodes performance independent of media. Selectivity to L. monocytogenes was evaluated by determining sensitivity and LOD in the presence of the identical concentration of another Gram-positive bacteria (S. aureus) in PBS and in sterile vegetable broth./p> 3.5 is noted as (EX), the collapsed brush conformation at pH < 3.5 is noted as (COL), the cell capture state is noted by (cap) and the electrochemical measurement step is noted by (meas). Cell capturing in the extended conformation (pH 7) and sensing at collapsed state (pH 3) provided the highest impedance values (p < 0.05) for all cutoff frequencies and, therefore, sensing efficiency (see also Bode plots in Fig. S3 in the supporting information). The optimum capture of targeted bacteria at the extended form can be related to a higher contact area with the tested solution and an increased probability of aptamer-cell interaction, compared to pH 3 at which the brushes are contracted, and the receptor binding site(s) may be inaccessible. Similar to our previous work on this capture strategy, it is likely that the cells become entangled in the polymer matrix during the sensing step, where aptamer-target binding may no longer be the mechanism for cell capture but rather entanglement during nanobrush collapse. The specificity for this detection platform is rooted in the initial affinity between aptamer and target at pH 7 (extended ALG-thiomer nanobrush), where the collapse at pH 3 likely causes secondary structure changes in the aptamer but also entraps cells in the polymer matrix./p> 0.05) on the LOD (4.5 ± 0.8 CFU mL−1 with L. monocytogenes alone and 5.7 ± 2.1 CFU mL−1 with both bacteria) indicating no cross-reaction between the sensor and S. aureus. The sensitivity increased (p < 0.05) from 39.21 ± 2.61 Ω/log(CFU mL−1) with L. monocytogenes alone to 69.34 ± 2.79 Ω/log (CFU mL−1) when S. aureus was also present. The linear range also changed from 101 to 106 CFU mL−1 with only L. monocytogenes in PBS to 101–105 CFU mL−1 in the bacteria mixture. Ohk et al.29 presented a LOD of 103 CFU mL−1 using the same aptamer in a fiber-optic biosensor to detect Listeria spp. Recently, Oliveira et al.31 using the same aptamer presented similar LODs compared to the current study for L. monocytogenes alone in PBS and in the presence of S. aureus, 2.5 and 2.6 CFU mL−1, respectively; using actuation of chitosan/platinum brushes. While antibody sensors are reported to be prone to give false-positive reactions with S. aureus, which is also a protein A carrier, the aptamer used in the present work was proven to be selective to L. monocytogenes29. This aptamer targets the surface protein Internalin A which is one of the major invasion proteins involved in pathogenesis29. Despite the fact that this protein is structurally analogous to certain cell-wall proteins with internal repeats identified in members of the genera Staphylococcus and Streptococcus65, the present results corroborate that this aptamer can be selective to L. monocytogenes./p> 0.05) to the results in PBS. These results also indicate that the aptamer is able to selectively bind to L. monocytogenes even in complex food matrices. Using the same aptamer, Hills et al.30 reported a slightly higher LOD of 9.1 CFU mL−1 in vegetable broth with a layer by layer reduced graphene oxide/nanoplatinum/chitosan brush electrode that actuated based on chitosan’s pH-response./p>
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